I. MỤC ĐÍCH                                         

Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện xét nghiệm song cầu gram âm nhuộm soi và nhận định sơ bộ hình ảnh vi khuẩn và các hình ảnh tế bào (nếu có) trực tiếp từ bệnh phẩm

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

   Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

HD:	Hướng dẫn
QC:	Quality control
QLCL:	Quản lý chất lượng
QTKT:	Quy trình kỹ thuật
VK:	Vi khuẩn
VS:	Vi sinh

VI. NGUYÊN LÝ

Đánh giá hình thể, kích thước, tính chất bắt màu, cách sắp xếp đặc trưng của vi khuẩn và các hình ảnh tế bào (nếu có) bằng kỹ thuật nhuộm và soi dưới kính hiển vi quang học.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

- Kính hiển vi

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Đồng hồ bấm giờ

- Dụng cụ sấy lam (nếu có)

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

Lọ lấy bệnh phẩm

Que cấy

Lam kính

Dầu soi kính

Cồn 90°lau kính

Nước muối sinh lý

Thuốc nhuộm đỏ fuchsin

Thuốc nhuộm tím gentian

Cồn tẩy 95%

Lugol

Thuốc nhuộm xanh methylen

Bông

Cồn 90°(vệ sinh dụng cụ)

Đèn cồn

Panh

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Mũ

Khẩu trang

Găng tay

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo bảo hộ

Acid ngâm lam

Ống nghiệm thủy tinh

Bút viết kính

Bút bi

Bật lửa

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch nước rửa tay

Khăn lau tay

Giấy trả kết quả xét nghiệm

7.3. Mẫu bệnh phẩm

• Mủ hoặc dịch tiết đường sinh dục, hậu môn, họng…

VIII. NỘI DUNG

8.1. Chuẩn bị

• Bệnh phẩm: Lấy bệnh phẩm theo đúng quy định của Sổ tay lấy mẫu - Khoa Vi Sinh
• Kiểm tra thông tin bệnh nhân trên phiếu yêu cầu xét nghiệm, kiểm tra thông tin và chất lượng mẫu bệnh phẩm.
• Khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện.
• Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học
• Chọn lam kính sạch, không xước. Hơ lam kính qua ngọn lửa đèn cồn để hủy chất dầu còn dính trên lam kính, để nguội lam tự nhiên.
• Đánh dấu tiêu bản bằng cách dùng bút chì đen HB ghi mã số bệnh phẩm lên đầu mờ lam kính.

8.2. Làm tiêu bản

• Bệnh phẩm dàn đều đặn liên tục tạo độ mịn dày vừa phải hình ô van kích thước dài 2 cm rộng 1cm.
• Ngâm que phết sau khi dàn vào dung dịch sát khuẩn phenol 5% hoặc Jave 0,5%.

8.3. Làm khô tiêu bản

• Đặt tiêu bản lên mâm kính và đê tiêu bản khô tự nhiên hoàn toàn ở nhiệt độ phòng (18-25°C).

Lưu ý: Không làm khô tiêu bản bằng đèn cồn hoặc ánh nắng mặt trời.

8.4. Cố định tiêu bản

• Thực hiện bên ngoài tủ an toàn sinh học
• Hơ nóng tiêu bản qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 3-4 làn, mỗi lần 3 giây.

Lưu ý: Không cố định khi tiêu bản chưa khô hoàn toàn.

8.5. Nhuộm màu

• Đặt tiêu bản lên giá nhuộm
• Phủ đầy dung dịch Tím gentians lên mặt phết tiêu bản đã được cố định.
• Để trong 1 đến 2 phút.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Phủ dung dịch lugol 1 phút.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Tẩy màu bằng cồn 90◦ đến khi bạc màu. 10 đến 30s.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ (lưu ý: Không xối vòi nước thẳng vào vết dàn)
• Phủ thuốc nhuộm Fuchsin kiềm 30 giây.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ..

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

• Soi tiêu bản bằng việc sử dụng kính hiển vi quang học vật kính dầu 100X theo hướng dẫn sử dụng kính hiển vi vật kính dầu mã hiệu VS.HD.03

+ Có song cầu gram âm khi quan sát thấy hình ảnh cầu khuẩn Gram âm xếp đôi, hình hạt cà phê nằm trong và ngoài bạch cầu đa nhân trung tính.

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

10.1. Kích cỡ mẫu bệnh phẩm trên lam kính

• Hình ovan nằm ở giữa lam
• Chiều rộng 1 cm, chiều dài 2 cm.

10.2. Độ mịn

• Bề mặt tiêu bản liên tục, đều đặn, không bị rỗng, bong.
• Soi kính: Các vi trường liên tục không có nhiều vi trường rỗng độ sáng đều.

10.3. Độ sạch

• Soi không thấy các cặn bẩn, cặn Fuchsin, tinh thể....
• Nếu thấy các cặn bẩn có thể do thuốc nhuộm để lâu

XI. AN TOÀN

Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm mã hiệu VS.QTQL.10.

XI. LƯU Ý

• Không gạt bỏ bệnh phẩm nổi trên miệng lọ, kết quả có thể bị sai.
• Để thời gian đúng quy định, nếu thời gian ngắn quá trứng giun chưa kịp nổi trên bề mặt dung dịch, kết quả có thể bị sai.

XII. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Sổ tay lấy mẫu bệnh phẩm Khoa Vi Sinh
Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi
Hướng dẫn sử dụng tủ an toàn sinh học
Quy trình trả kết quả xét nghiệm Khoa Vi Sinh