I. MỤC ĐÍCH

Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện xét nghiệm vi hệ đường ruột và đánh giá tỷ lệ các loại vi khuẩn có mặt trong bệnh phẩm phân.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

HD	Hướng dẫn
QC	Quality control
QLCL	Quản lý chất lượng
QTKT	Quy trình kỹ thuật
VK	Vi khuẩn
VS	Vi sinh

VI. NGUYÊN LÝ

Dựa vào quan sát hình thể và tính chất bắt màu khi nhuộm đơn và nhuộm Gram để đánh giá một cách tương đối tỷ lệ các loại vi khuẩn Gram âm, Gram dương có mặt trong phân.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

- Kính hiển vi quang học

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

Lọ lấy bệnh phẩm

Lam kính

Que cấy

Dầu soi kính

Cồn 96° lau kính

Nước muối sinh lý

Thuốc nhuộm đỏ fuchsin

Thuốc nhuộm tím gentian

Cồn tẩy 95%

Lugol

Thuốc nhuộm xanh methylen

Bông

Cồn 90° (vệ sinh dụng cụ)

Đèn cồn

Panh

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Mũ

Khẩu trang

Găng tay

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo bảo hộ

Acid ngâm lam

Ống nghiệm thủy tinh

Bút viết kính

Bút bi

Bật lửa

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch nước rửa tay

Khăn lau tay

Giấy trả kết quả xét nghiệm

7.3. Mẫu bệnh phẩm

• Phân

VIII. NỘI DUNG

8.1. Chuẩn bị

• Bệnh phẩm: Lấy bệnh phẩm theo đúng quy định của Sổ tay lấy mẫu - Khoa Vi Sinh
• Kiểm tra thông tin bệnh nhân trên phiếu yêu cầu xét nghiệm, kiểm tra thông tin và chất lượng mẫu bệnh phẩm.
• Khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện.
• Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học
• Chọn lam kính sạch, không xước. Hơ lam kính qua ngọn lửa đèn cồn để hủy chất dầu còn dính trên lam kính, để nguội lam tự nhiên.
• Đánh dấu tiêu bản bằng cách dùng bút chì đen HB ghi mã số bệnh phẩm lên đầu mờ lam kính..

8.2. Dàn tiêu bản

• Thực hiện trong tủ an toàn sinh học
• Bệnh phẩm dàn đều đặn liên tục tạo độ mịn dày vừa phải hình ô van kích thước dài 2 cm rộng 1cm.
• Ngâm que phết sau khi dàn vào dung dịch sát khuẩn.

8.3. Làm khô tiêu bản

• Đặt tiêu bản lên mâm kính và đê tiêu bản khô tự nhiên hoàn toàn ở nhiệt độ phòng (18-25°C).

8.4. Cố định tiêu bản

• Thực hiện bên ngoài tủ an toàn sinh học
• Hơ nóng tiêu bản qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 3-4 làn, mỗi lần 3 giây.

Lưu ý: Không cố định khi tiêu bản chưa khô hoàn toàn.

8.5. Nhuộm màu

Nhỏ dung dịch tím gentian phủ kín nơi dàn bệnh phẩm. Duy trì 1 phút.

- Rửa duổi tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ.

- Nhỏ dung dịch lugol, để 1 phút.

- Rửa đuổi tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ.

- Tẩy màu: nhỏ vài giọt cồn 95% lên tiêu bản, duy trì 5-10s, rửa nước ngay.

- Nhỏ dung dịch đỏ Fuchsin, để 1 phút.

- Rửa đuổi dưới vòi nước chảy nhẹ.

- Để khô tiêu bản, soi dưới kính hiển vi.

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

Đánh giá hình ảnh tế bào trên tiêu bản nhuộm đơn.

Đánh giá hình ảnh vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram

- Soi dưới vật kính dầu (100X)

- Diễn giải và đọc kết quả:

• Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím sẫm Gentian.
• Vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ Fuchsin.
• Vi hệ đường ruột bình thường khi có 70% trực khuẩn Gram âm và 30% liên cầu và các trực khuẩn Gram dương khác.
• Loạn khuẩn khi tỷ lệ các loại vi khuẩn trên thay đổi và/hoặc xuất hiện bào tử nấm.

 

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

10.1. Kích cỡ mẫu bệnh phẩm trên lam kính

• Hình ovan nằm ở giữa lam
• Chiều rộng 1 cm, chiều dài 2 cm.

10.2. Độ mịn

• Bề mặt tiêu bản liên tục, đều đặn, không bị rỗng, bong.
• Soi kính: Các vi trường liên tục không có nhiều vi trường rỗng độ sáng đều.

10.3. Độ sạch

• Soi không thấy các cặn bẩn, cặn Fuchsin, tinh thể....
• Nếu thấy các cặn bẩn có thể do thuốc nhuộm để lâu.

XI. AN TOÀN

Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm mã hiệu VS.QTQL.10.

XI. LƯU Ý

• Gram dương giả: Tẩy cồn chưa đủ thời gian
• Gram âm giả:

+  Tuổi của mẫu cấy vi khuẩn ảnh hưởng lên tính chất nhuộm Gram ở

các mẫu cấy vi khuẩn để thời gian quá lâu.

+  Tẩy cồn quá lâu và tráng không kỹ.

• Nhuộm lại tiêu bản khi nghi ngờ kết quả không chính xác.

XII. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Sổ tay lấy mẫu bệnh phẩm khoa Vi sinh
Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi
Hướng dẫn sử dụng tủ an toàn sinh học
Quy trình trả kết quả xét nghiệm Khoa Vi Sinh