Banner
Banner đại hội đảng PC
Banner đại hội đảng điện thoại

VS.QTKT.SHPT.24 QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV-SACACE

(Cập nhật: 6/7/2020)

VS.QTKT.SHPT.24 QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV-SACACE

I. MỤC ĐÍCH

            HIV đo tải lượng hệ thống tự động là xét nghiệm khuếch đại bằng Real-time dùng để phát hiện đo tải lượng RNA Human Immunodeficiency virus 1 (HIV-1) trong huyết tương  người.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

   Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

  • Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học
  • Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.
  • HIV Real-TM Quant Dx. Kit Real-time PCR phát hiện và đo tải lượng Virus Human Immunodeficiency (HIV) trong huyết tương người. Sacace Biotechnologies.

IV. TRÁCH NHIỆM

  • Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
  • Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
  • Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

RT - PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleotit Nucleic Acid

BP

Bệnh Phẩm

IC

Internal Control

HIV

Human Immunodeficiency Virus

 

VI. NGUYÊN LÝ

            HIV Real-TM Quant Dx là xét nghiệm dùng để phát hiện đo tải lượng RNA virus Human Immunodeficiency 1 (HIV-1) trong huyết tương người. RNA HIV tách chiết từ huyết tương, sử dụng phương pháp Real-time PCR để khuếch đại và sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang ở mẫu dò phát hiện HIV hoặc IC HIV. Sự khuếch đại của cả hai mục tiêu (HIV và IC) diễn ra đồng thời trong cùng một mẫu phản ứng. Theo dõi cường độ huỳnh quang trong thời gian Real-time cho phép phát hiện và đo tải lượng sản phẩm tích lũy mà không cần phải mở ống phản ứng sau khi khuếch đại Real-time.

            Trình tự mục tiêu cho HIV Real-TM Quant Dx là gen pol của bộ gen HIV. Đây là vùng đặc trưng và bảo tồn cao trong HIV.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

- Tủ lạnh 2°C - 8°C

- Tủ âm sâu (-20°C)

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

- Máy vortex

- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

- Bộ lưu điện

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

- Kit Real-time PCR phát hiện và đo tải lượng Virus Human Immunodeficiency (HIV) trong huyết tương người

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm   

- Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

- Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

- Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

- Giấy thấm 

- Giấy xét nghiệm 

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

- Bút viết kính 

- Bút bi 

- Mũ 

- Khẩu trang 

- Găng không có bột

- Găng tay xử lý dụng cụ 

- Quần áo bảo hộ 

- Dung dịch nước rửa tay 

- Cồn sát trùng tay nhanh 

- Dung dịch khử trùng 

- Khăn lau tay 

- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

7.3. Mu bệnh phẩm

            - Sử dụng huyết tương giữ trong EDTA hoặc citrate, không sử dụng mẫu máu chống đông với heparin.

            - Máu toàn phần thu nhận trong EDTA nên được tách riêng phần huyết tương và các tế bào bằng phương pháp ly tâm. Huyết tương có thể được giữ trong 3 ngày ở 2-8°C, hoặc trong một tháng ở -18°C, có thể lên đến một năm khi giữ ở -70°C.

            - Không được đông lạnh máu toàn phần.  5. Máu toàn phần phải được vận chuyển ở 2-15°C và sử dụng trong khoảng 6 giờ sau khi thu nhận. Huyết tương có thể được vận chuyển ở 2-8°C hoặc đông lạnh

            - Lấy mẫu bệnh phẩm theo Sổ tay lấy mẫu bệnh phẩm của khoa Vi Sinh.

VIII. NỘI DUNG

8.1. Chuẩn bị

Bước 1. Đánh số thứ tự các mẫu bệnh  phẩm; ghi nhãn; dán và đánh dấu  lên ống effendorf  loại 1,5 ml để đựng huyết thanh

Bước 2. Khởi động tủ an toàn sinh học

Bước 3. Khởi động máy tách chiết DNA – RNA  tự động

Bước 4. Ly tâm ống máu để tách huyết tương

Bước 5. Sử dụng pipette để hút huyết tương vào ống effendorf  loại 1,5 ml đã dán nhãn và ghi số thứ tự.

8.2. Quy trình tách chiết DNA bằng hệ thống tự động

8.2.1. Chuẩn bị thuốc thử

1. Chuẩn bị ống Control và CAL1/CAL2 sử dụng cho đo tải lượng, ly tâm nhanh.

2. Bổ sung Negative Control (CONTROL -) vào theo bảng dưới:

Thuốc thử

CONTROL -, µl

CAL 1

1200

CAL 2

1200

CONTROL 1

1200

CONTROL 2

1200

CONTROL INT

300

 

2. Ủ tất cả các ống trong 2 phút ở nhiệt độ phòng. Vortex đều.

3. Ly tâm trong khoảng 5 giây.

4. Các thuốc thử đã hòa tan phải được giữ ở 2-8oC và luôn luôn tránh sáng, sử dụng trong 30 ngày (không được đông lạnh).

8.2.3. Quy trình tách chiết HCV bằng hệ thống tự động

            1. Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn

            2. Hút 10µl RNA carier  vào ống đựng bệnh phẩm, CAL1 và CAL2, Control1, control 2

            3. Thêm 10 µl CONTROL INT vào mỗi ống.

            4. Cho 200µl huyết tương  mẫu, CAL1 và CAL2, Control1, Control 2 vào ống có chứa hỗn hợp RNA carier, CONTROL INT

            5. Tách chiết RNA thực hiện theo quy trình tách chiết DNA - RNA bằng hệ thống tự động

8.3. Khởi động máy và khai báo chương trình chạy

Bước 1: Khởi động máy:

            - Bật máy real-time PCR ít nhất 20 phút trước khi chạy chương trình, tín hiệu đèn màu xanh hiển thị khởi động máy thành công.

            - Mở chương trình phần mềm ở máy tính RealTime – PCR v7.3

            - Kiểm tra kết nối giữa máy tính và real – time PCR: nút màu xan là kết nối thành công.

Bước 2: Khai báo trên PCR plate

            - Chon chương trình HIV- Real-TM Quant Dx

            - Chọn số lượng mẫu, Standards, Controls

            - Điền ký hiệu mẫu, CAL1, CAL 2, Control1, Control 2, chọn vị trí đặt ống PCR

            - Đối với CAL1,CAL2 cần điền giá trị Concentration (copies/ml) của Lot hóa chất vào HEX. Hệ số quy đổi 1 IU/ml = 0,58 copies/ml

Bước 3: Thiết lập chu trình nhiệt trên máy Real time theo hướng dẫn sau

 

Stage

Temp, oC

Time

Flourescense detection

Cycle repeat

Hold

50

30 min

-

1

Hold

95

15 min

-

1

Cycling

95

20s

-

5

52

30s

-

72

30s

-

Cycling

95

20s

-

42

55

40s

FAM/ Green, JOE/Yellow

72

30s

 

 

8.4. Chạy Real Time PCR định lượng HCV

Bước 1. Chuẩn bị tủ vô trùng và đặt các kit 0,2ml có chứa master mix HCV, đặt ống trên giá lạnh.

Bước 2. Ly tâm các tube chứa master mix để hóa chất lắng xuống đáy ống.

Bước 3. Đánh dấu các ký hiệu mẫu BP tương ứng lên các tube PCR. Viết ký hiệu lên thành ống, tuyệt đối không viết ký hiệu lên nắp ống vì máy đọc tín hiệu huỳnh quang từ nắp trên nắp.

Bước 4. Hút 50 µl CAL1, CAL2,  RNA BP, Control1, control2  vào các ống PCR tương ứng. Thao tác mẫu nào chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng chặt nắp tube lại để tránh lây nhiễm

Lưu ý: Trộn đều RNA BP trước khi hút, với RNA BP bảo quản -200C phải để tan đá và trộn đều,

Bước 5. Ly tâm các ống PCR để toàn bộ dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

Bước 6. Dùng giấy thấm sạch nắp ống trước khi đậy nắp máu. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây nhiễu tín hiệu huỳnh quang và kết quả RT-PCR sẽ không chính xác.

Bước 7. Ấn nút Play để chạy chương trình trên phần mềm và lưu file chạy vào máy tính.

8.5. Đọc kết quả

            Sau khi kết thúc quá trình RT-PCR, chuyển sang chế độ Analysis và dựa vào đường chuẩn để phân tích

8.5.1. Thiết lập đường chuẩn

            Dựa vào nồng độ của 3 mẫu CAL1 và 3 mẫu CAL2 để xây dựng đường chuẩn. Đường chuẩn bao gồm 2 điểm chuẩn, mỗi điểm lặp lại 3 lần với nồng độ khác nhau cho từng lot sản phẩm giúp kiểm soát kết quả định lượng, chỉ cần chạy 1 đường chuẩn HIV (Standard) cho mỗi lot sản xuất.

8.5.2. Diễn giải kết quả

            Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả. IC được phát hiện trên kênh FAM/Green và RNA HIV trên kênh Joe/Yellow/HEX.

            Giới hạn trên của xét nghiệm đo tải lượng HIV-TM Quant Dx là 10.000.000 IU/mL. Giới hạn dưới bằng giới hạn phát hiện LOD (48 IU/mL với thể tích mẫu vào là 1 mL).

            Độ nhạy của xét nghiệm HIV-TM Quant Dx là 48 IU/mL với thể tích mẫu là 1 mL

Bước 1: phân tích chứng âm và chứng dương, lựa chọn các giếng chứng âm và chứng dương, chọn lần lượt màu HEX và FAM để phân tích. Mẫu chứng âm và chứng dương đạt yêu cầu nếu:

       Chứng dương có tín hiệu huỳnh quang màu HEX tuyến tính vượt quá tín hiệu nền và có FAM dương tính.

       Chứng âm có tín hiệu huỳnh quang màu HEX âm tính và có FAM dương tính.

Bước 2: Phân tích mẫu BP, chọn các mẫu BP và lựa chọn màu HEX, chia các nhóm đường biểu diễn có các tín hiệu huỳnh quang như sau:

            Nhóm 1: Mẫu dương tính mạnh có đường biểu diễn chuẩn

       Nhóm 2: Mẫu dương tính yếu có đường biểu diễn chuẩn

       Nhóm 3: Mẫu âm tính

       Nhóm 4: Mẫu nhiễu có đường biểu diễn không chuẩn

Bước 3: Phân tích mẫu nhóm 1 và nhóm 2

       Chọn các CAL1, CAL2, chứng âm và các mẫu thuộc nhóm 1 và nhóm 2, kéo baseline càng sát đường biểu diễn của chứng âm càng tốt, đồng thời cao hơn tín hiệu nhiễu cao nhất và các thông số của đường chuẩn phải đạt yêu cầu.

       Tiến hành lấy kết quả ở trên cửa sổ bên trái để xác định nồng độ của mẫu BP.

Bước 4: Phân tích mẫu nhóm 3.

       Chọn các giếng của mâu âm, chọn màu HEX sau đó đến màu FAM. Những mẫu âm tính với màu HEX và dương tính với màu FAM, kết luận mẫu âm tính với HCV.

Những mẫu âm tính với cả màu FAM và màu HEX là mẫu âm tính giả, cần tách chiết lại RNA hoặc pha loãng RNA và tiến hành RT-PCR lại.

Bước 5. Phân tích mẫu nhóm 4

       Chọn những mẫu có tín hiệu huỳnh quang bất thường, chọn màu FAM và HEX, kiểm tra ở chế độ dữ liệu thô (monitoring).

       Nếu có đường biểu diễn âm tính với màu HEX và dương tính với màu FAM, kết luận mẫu âm tính.

       Những mẫu có tín hiệu dương tính nhiễu trước chu kỳ 05 là dương tính giả.

       Nếu đường biểu diễn dương tính với màu HEX, chọn những mẫu này, standard và chứng âm. Thay đổi giá trị trên trục y để phóng đại tín hiệu huỳnh quang, đưa về chế độ Analysis, kéo đường baseline về sát tín hiệu nhiễu cao nhất và đọc kết quả.

X. LƯU Ý

10.1. Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn

- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao

- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)

10.2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm

- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm

- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm

XI. HỒ SƠ LƯU

  • Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu

Mã tài liệu

Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm

 

Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm

 

Quy trình an toàn phòng xét nghiệm

 

 

 

(Lượt đọc: 1085)

Tin tức liên quan

  • Quảng cáo
    • Banner đại hội đảng PC
  • Cấp cứu 115
  • Đường dây nóng
  • Khuyến cáo phòng chống bệnh viêm phổi cấp do vi rút Corona
  • Học tập làm theo lời bác
  • Chương trình mục tiêu quốc gia
  • Đại hội đảng
  • Lịch công tác
  • Hình ảnh hoạt động
  • Câu lạc bộ Tim mạch
  • Câu lạc bộ Tiểu đường
  • Câu lạc bộ Hen - COPD
  • Liên kết web
    • Bộ Y Tế
    • Bất Động Sản
    • Báo Quảng Ninh
    • Sở Y tế Quảng Ninh
    • Báo cáo hoạt động khám chữa bệnh
    • Bệnh viện Bãi Cháy
    • Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh
    • CDC
    • Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm
    • Bệnh viện Cẩm phả
    • Bệnh viện Đa khoa khuc vực Cẩm phả
    • Bệnh viện Lao và phổi
    • Bệnh viện Phục hồi chức năng Quảng Ninh
    • Bệnh viện Việt Nam Thụy Điển Uông Bí
    • Bệnh viện Y dược cổ truyền Quảng Ninh
    • Trung tâm y tế Hạ Long
    • Trung tâm Y tế huyện Ba Chẽ
    • Trung tâm Y tế huyện Bình Liêu
    • Trung tâm Y tế huyện Đầm Hà
    • Trung tâm Y tế huyện Hải Hà
    • Trung tâm Y tế huyện Hoành Bồ
    • Trung tâm Y tế huyện Tiên Yên
    • Trung tâm Y tế huyện Vân Đồn
    • Trung tâm Y tế Thành phố Cẩm Phả
    • Trung tâm Y tế Thành phố Móng Cái
    • Trung tâm Y tế Thành phố Uông Bí
    • Trung tâm Y tế thị xã Đông Triều
    • Trung tâm Y tế thị xã Quảng Yên
    • Bệnh viện 108
    • Trung tâm DI & ADR quốc gia
    • Bệnh viện Bạch Mai
    • Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ
    • Bệnh viện Việt Đức
    • Sở Y tế tỉnh Phú Thọ
    • Bất động sản Việt Nam