I. MỤC ĐÍCH

            Đếm số lượng bản copies của CMV DNA trong một đơn vị thể tích (ml) huyết tương hoặc huyết thanh bằng hệ thống tự động.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

      Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction
DNA	Deoxyribose Nucleic Acid
BP	Bệnh Phẩm
IC	Internal Control
CMV	Cytomegalovirus
RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction

VI. NGUYÊN LÝ

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR nhằm xác định DNA của CMV

Đối chứng (IC) được bổ sung từ bước tách chiết để kiểm soát chất lượng của quá trình tách chiết DNA và PCRDNA của CMV được phát hiện trên kênh FAM, IC được phát hiện trên kênh JOE/HEX/Cy3

Độ nhạy: mẫu phết đường sinh dục 1000 GE/ml, mẫu nước tiểu 2х103 GE/ml.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

- Tủ lạnh 2°C - 8°C

- Tủ âm sâu (-20°C)

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

- Máy vortex

- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

- Bộ lưu điện

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

- Kít định lượng virus HBV Real-TM (HBV Real-TM Quant Dx): Đạt tiêu chuẩn ISO 9001:2008 & 13485:2012.

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

- Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

- Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

- Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

- Giấy thấm 

- Giấy xét nghiệm 

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

- Bút viết kính 

- Bút bi 

- Mũ 

- Khẩu trang 

- Găng không có bột

- Găng tay xử lý dụng cụ 

- Quần áo bảo hộ 

- Dung dịch nước rửa tay 

- Cồn sát trùng tay nhanh 

- Dung dịch khử trùng 

- Khăn lau tay 

- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

7.3. Mẫu bệnh phẩm

- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.

VIII. NỘI DUNG

8.1. Chuẩn bị

   - Khởi động tủ an toàn sinh học thực hiện theo quy trình vận hành tủ an toàn sinh học mã số….

   - Khởi động máy tách chiết DNA – RNA  thực hiện theo quy trình vận hành máy tách chiết DNA – RNA tự động mã số …….

   - Đánh số thứ tự các mẫu bệnh  phẩm; ghi nhãn; dán và đánh dấu  lên ống effendorf  loại 1,5 ml để đựng huyết thanh

   -  Ly tâm ống máu để tách huyết thanh thực hiện theo quy trình vận hành máy ly tâm mã số ……

   - Sử dụng pipette để hút huyết thanh vào ống effendorf  loại 1,5 ml đã dán nhãn và ghi số thứ tự. Sử dụng pipette theo quy trình hướng dẫn sử dụng pipette mã số…..

8.2. Quy trình tách chiết DNA bằng hệ thống tự động

- Ống máu chứa BỆNH PHẨM được ly tâm để tách lấy huyết tương

- Sử dụng pipette để hút huyết thanh vào ống effendorf  loại 1,5 ml đã dán nhãn và ghi số thứ tự.

- Chuẩn bị 3 mẫu CAL1, 3 mẫu CAL2 cho mỗi lần chạy đường chuẩn.

- Chuẩn bị mẫu chứng dương và mẫu chứng âm.

* Pha stock

+ Cho Negative control (CONTRO -) vào các ống theo bảng sau:

Controls	CONTROL -, µl
CAL 1	1200
CAL 2	1200
CONTROL 1	1200
CONTROL 2	1200
CONTROL INT	300

+ Đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng 2 phút, vortex đều.

+ Ly tâm 5 giây

+ Bảo quản ở nhiệt độ 2-8^°C, bảo quản tránh ánh nắng trong 30 ngày.

Bước 3: Chạy Real Time PCR bằng hệ thống máy SaCycler – 96 Real Time PCR System

- Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn

- Đánh số thứ tự mẫu, 3 mẫu CAL1, 3 mẫu CAL 2, chứng dương, chứng âm vào ống đựng mẫu và ống đựng DNA trên khay đựng mẫu của máy tách chiết DNA – RNA tự động.

- Sử dụng micropipette  hút 10µl RNA carier  và 10µl CMV – IC vào các ống đựng bệnh phẩm

- Sử dụng micropipette  hút 200 µl, mẫu CAL1. CAL2, chứng dương, chứng âm vào các ống đựng theo số thứ tự

- Đặt khay đựng mẫu vào máy tách chiết DNA – RNA tự động

- Sử dụng đầu đọc mã code FCO AS – 8120 để nhập protocol barcode, sample volume, elution tube type và elution volume vào máy.

- Ấn nút Enter trên màn hình để máy bắt đầu tách chiết DNA.

- Sau khi máy tách chiết DNA – RNA chạy xong, lấy DNA ra khỏi máy, loại bỏ các Protocol và bật tia UV để khử trùng máy.

- Chuẩn bị tủ vô trùng và đặt các Kit định lượng virus CMV Real-TM lên giá lạnh.

- Ký hiệu mẫu DNA theo thứ tự. Viết ký hiệu lên thành ống, tuyệt đối không viết ký hiệu lên nắp ống vì máy đọc tín hiệu huỳnh quang từ nắp trên nắp.

- Ly tâm các tube chứa master mix để hóa chất lắng xuống đáy ống.

- Hút 50 µl CAL1, CAL2,  DNA mẫu, chứng âm và chứng dương vào các ống PCR tương ứng. Thao tác mẫu nào chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng chặt nắp tube lại để tránh lây nhiễm.

Lưu ý: Trộn đều DNA BỆNH PHẨM trước khi hút, với DNA BỆNH PHẨM bảo quản -20^°C phải để tan đá và trộn đều,

- Ly tâm các ống PCR để toàn bộ dịch lắng xuống đáy ống.

Bước 5: Khởi động máy và khai báo chương trình chạy.                           

- Khởi động máy RT – PCR ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

- Mở phần mềm Realtime – PCR

- Chọn Operator: Khoa Vi sinh

- Chọn Device  handing

- Chọn thiết bị List devices

- Chọn chương trình chạy: CMV Real – TM Quant DX

Stage	Temp, oC	Time	Flourescense detection	Cycle repeat
Hold	95	15s	-	1
Cycling	95	5s	-	5
	60	20s	-
	72	15s	-
Cycling	95	5s	-	40
	60	30s	FAM, JOE/HEX/Cy3
	72	15s

- Chọn số lượng mẫu vào phần Sample, số lần lặp lại Replicas

- Chọn standards và Controls

- Chọn vị trí đặt mẫu.

- Đặt các mẫu DNA vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

- Dùng giấy thấm sạch nắp ống trước khi đậy nắp máu.Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây nhiễu tín hiệu huỳnh quang và kết quả RT-PCR sẽ không chính xác.

- Ấn Start để máy chạy chương trình trên phần mềm tiến hành định lượng CMV- DNA và lưu file chạy vào máy tính.

 IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

Sau khi kết thúc quá trình RT-PCR, chuyển sang chế độ Analysis và dựa vào đường chuẩn để phân tích

1. Xây dựng đường chuẩn

Dựa vào nồng độ của 3 mẫu CAL1 và 3 mẫu CAL2 để xây dựng đường chuẩn. Đường chuẩn bao gồm 2 điểm chuẩn, mỗi điểm lặp lại 3 lần với nồng độ khác cho từng lot sản phẩm giúp kiểm soát kết quả định lượng, chỉ cần chạy 1 đường chuẩn CMV (standard) cho mỗi lot sản xuất.

2.  Phân tích kết quả

Bước 1: Phân tích chứng âm và chứng dương, lựa chọn các giếng chứng âm và chứng dương, chọn lần lượt màu HEX và FAM để phân tích. Mẫu chứng âm và chứng dương đạt yêu cầu nếu:

   Chứng dương có tín hiệu huỳnh quang màu HEX tuyến tính vượt quá tín hiệu nền và có FAM dương tính.

   Chứng âm có tín hiệu huỳnh quang màu HEX âm tính và có FAM dương tính.

 Bước 2: Phân tích mẫu BỆNH PHẨM, chọn các mẫu BỆNH PHẨM và lựa chọn màu HEX, chia các nhóm đường biểu diễn có các tín hiệu huỳnh quang như sau:

   Nhóm 1: Mẫu dương tính mạnh có đường biểu diễn chuẩn

   Nhóm 2: Mẫu dương tính yếu có đường biểu diễn chuẩn

   Nhóm 3: Mẫu âm tính

   Nhóm 4: Mẫu nhiễu có đường biểu diễn không chuẩn

Bước 3: Phân tích mẫu nhóm 1 và nhóm 2

- Chọn các CAL1, CAL2, chứng âm và các mẫu thuộc nhóm 1 và nhóm 2, kéo baseline càng sát đường biểu diễn của chứng âm càng tốt, đồng thời cao hơn tín hiệu nhiễu cao nhất và các thông số của đường chuẩn phải đạt yêu cầu.

- Chọn Analysis type            Chọn Quantitative with standards để xác định nồng độ DNA – CMV của mẫu BỆNH PHẨM. Kit định lượng CMV có thể phát hiện nồng độ DNA-CMV trong huyết thanh bệnh nhân từ 9,8 -1,7x10⁷ copies/ml.

- Kết luận:  mẫu dương tính (số lượng copies/ml)

   Mẫu định lượng <9,8 copies/ml à kết luận mẫu dương tính dưới ngưỡng định lượng

Mẫu định lượng>1,7x10⁷ copies/ml à pha loãng mẫu chạy lại

Bước 4: Phân tích mẫu nhóm 3

- Chọn các giếng của mẫu âm, chọn màu HEX sau đó đến màu FAM. Những mẫu âm tính với màu HEX và dương tính với màu FAM à kết luận mẫu âm tính.

- Những mẫu âm tính với cả màu FAM và màu HEX là mẫu âm tính giả, cần tách chiết lại DNA hoặc pha loãng DNA và tiến hành RT-PCR lại.

Bước 5. Phân tích mẫu nhóm 4

- Chọn những mẫu có tín hiệu huỳnh quang bất thường, chọn màu FAM và HEX, kiểm tra ở chế độ dữ liệu thô (monitoring).

   Nếu có đường biểu diễn âm tính với màu HEX và dương tính với màu FAM à kết luận mẫu âm tính.

   Những mẫu có tín hiệu dương tính nhiễu trước chu kỳ 05 là dương tính giả.

   Nếu đường biểu diễn dương tính với màu HEX, chọn những mẫu này, standard và chứng âm. Thay đổi giá trị trên trục y để phóng đại tín hiệu huỳnh quang, đưa về chế độ Analysis, kéo đường baseline về sát tín hiệu nhiễu cao nhất và đọc kết quả.

X. LƯU Ý

10.1. Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn

- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao

- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)

10.2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm

- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm

- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm

XI. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm
Quy trình an toàn phòng xét nghiệm
Hướng dẫn sử dụng kit real-time PCR định lượng CMV