I. MỤC ĐÍCH

            Xác định DNA đặc trưng của Neisseria miningitides bằng hệ thống tự động.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

      Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction
DNA	Deoxyribose Nucleic Acid
BP	Bệnh Phẩm
IC	Internal Control
RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction

VI. NGUYÊN LÝ

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện gene của Neisseria miningitides theo nguyên lý phương pháp realtime – PCR.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

- Tủ lạnh 2°C - 8°C

- Tủ âm sâu (-20°C)

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

- Máy vortex

- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

- Bộ lưu điện

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

- Kít định lượng virus HBV Real-TM (HBV Real-TM Quant Dx): Đạt tiêu chuẩn ISO 9001:2008 & 13485:2012.

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

- Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

- Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

- Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

- Giấy thấm 

- Giấy xét nghiệm 

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

- Bút viết kính 

- Bút bi 

- Mũ 

- Khẩu trang 

- Găng không có bột

- Găng tay xử lý dụng cụ 

- Quần áo bảo hộ 

- Dung dịch nước rửa tay 

- Cồn sát trùng tay nhanh 

- Dung dịch khử trùng 

- Khăn lau tay 

- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

7.3. Mẫu bệnh phẩm

- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.

VIII. NỘI DUNG

Bước 1. Chuẩn bị

- Khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

- Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học

- Khởi động máy tách chiết DNA/RNA tự động SaMag 12–Sacase Biotechnology

- Đánh số thứ tự các mẫu bệnh  phẩm; ghi nhãn; dán và đánh dấu  lên ống faclcon 15ml và effendorf  loại 1,5 ml để đựng mẫu BỆNH PHẨM.

Bước 2. Tách chiết DNA bằng hệ thống tự động (theo quy trình tách chiết DNA/RNA tự động)

- Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn

- Đánh số thứ tự mẫu BỆNH PHẨM, chứng dương, chứng âm vào ống đựng BỆNH PHẨM và ống đựng DNA trên khay đựng BỆNH PHẨM của máy tách chiết DNA/RNA tự động.

- Sử dụng micropipette  hút 10µl RNA carier  và 10µl NEISSERIA MININGITIDES –IC vào các ống đựng bệnh phẩm

- Sử dụng micropipette  hút 200 µl BỆNH PHẨM, chứng dương, chứng âm vào các ống đựng BỆNH PHẨM theo số thứ tự

- Đặt khay đựng mẫu BỆNH PHẨM vào máy tách chiết DNA – RNA tự động

- Sử dụng đầu đọc mã code FCO AS – 8120 để nhập protocol barcode, sample volume, elution tube type và elution volume vào máy.

- Ấn nút Enter trên màn hình để máy bắt đầu tách chiết DNA.

- Sau khi máy tách chiết DNA – RNA chạy xong, lấy RNA ra khỏi máy, loại bỏ các Protocol và bật tia UV để khử trùng máy.

- DNA sau khi được tách chiết phải bảo quản ở tủ -20°C.

Bước 3: Chạy Real Time PCR bằng hệ thống máy SaCycler – 96 Real Time PCR System

- Khởi động máy RT – PCR ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

- Mở phần mềm Realtime – PCR

- Chọn Operator: Khoa Vi sinh

- Chọn Device  handing

- Chọn thiết bị List devices

- Chọn chương trình chạy: NEISSERIA MININGITIDES  Real – TM

Stage	Temp, oC	Time	Flourescense detection	Cycle repeat
Hold	95	15 min	-	1
Cycling	95	10s	-	45
	56	20s	FAM, JOE/HEX/Cy3
	72	10s

- Chọn số lượng mẫu vào phần Sample, số lần lặp lại Replica

- Chọn Controls: positive (C+) và Negative (C-)

- Chọn vị trí đặt mẫu.

- Đặt các mẫu DNA vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

- Dùng giấy thấm sạch nắp ống trước khi đậy nắp máu.Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây nhiễu tín hiệu huỳnh quang và kết quả RT-PCR sẽ không chính xác.

- Ấn Start để máy chạy chương trình trên phần mềm tiến hành xác định DNA - NEISSERIA MININGITIDES  và lưu file chạy vào máy tính.

 IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu BỆNH PHẨM.

- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.

- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại  hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Kiểm tra độ nhạy của master mix

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Đọc kết quả Ct của chứng (+), số copy 100 - Ct = 30 - <33.36 là khoảng chấp nhận được.

Bước 4: Xác định mẫu dương tính NEISSERIA MININGITIDES

- Chọn từng mẫu BỆNH PHẨM + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM

- Mẫu BỆNH PHẨM có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct: là những mẫu dương tính NEISSERIA MININGITIDES

- Các mẫu BỆNH PHẨM có Ct <12 và tín hiệu huỳnh quang không tăng theo chu kỳ nhiệt: pha loãng DNA mẫu BỆNH PHẨM với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix

Bước 5: Xác định mẫu BỆNH PHẨM âm tính NEISSERIA MININGITIDES

- Chọn từng mẫu BỆNH PHẨM + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Mẫu BỆNH PHẨM không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu HEX, thì kết quả là mẫu BỆNH PHẨM âm tính với NEISSERIA MININGITIDES

- Nếu mẫu BỆNH PHẨM có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM nhưng không có Ct và dương tính với màu HEX, thì kết quả là NEISSERIA MININGITIDES  trong BỆNH PHẨM dưới ngưỡng phát hiện

- Nếu mẫu BỆNH PHẨM không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu HEX, thì mẫu BỆNH PHẨM bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

X. LƯU Ý

10.1. Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn

- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao

- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)

10.2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm

- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm

- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm

XI. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm
Quy trình an toàn phòng xét nghiệm
Hướng dẫn sử dụng kit real-time PCR xác định NEISSERIA MININGITIDES