I. MỤC ĐÍCH

Quy trình nhằm đánh giá số lượng coliform có trong nước thải sau xử lý.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Quy trình này được áp dụng để kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật trong không khí tại các khoa phòng trong Bệnh viện Đa khoa tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành vi sinh vật y học – Bộ Y tế 01/2013

IV. TRÁCH NHIỆM

Nhân viên xét nghiệm khoa vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực hiện theo đúng quy trình

Người thực hiện: cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên nghành vi sinh, làm việc tại khoa Vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh

V.ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

Định nghĩa, thuật ngữ:

• Tài liệu: là các loại văn bản pháp quy hoặc có tính pháp quy dùng làm căn cứ để xử lý,
• Kiểm tra: Là sự xem xét sự phù hợp của tài liệu với các nội dung và yêu cầu của tiêu chuẩn
• Phê duyệt: Xác nhận của người có thẩm quyền về sự phù hợp và tính hiệu lực của tài liệu trong hệ thống
• Lần ban hành: là lần phát hành ra một tài liệu mới, được bắt đầu từ 01, mỗi lần ban hành tiếp theo sẽ tăng thêm một đơn vị.
• Lần sửa đổi: là số lần phát hành một trang tài liệu sau khi sửa đổi, được bắt đầu từ 01, mỗi lần sửa đổi tiếp theo sẽ tăng thêm một đơn vị.

Chữ viết tắt:

EQAS:	External quality assessment scheme
KTV:	Kỹ thuật viên
TP. QLCL:	Trưởng phòng quản lý chất lượng
QC:	Quality control
QT:	Quy trình

VI. NGUYÊN LÝ

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

- Kính hiển vi quang học

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ ấm thường

- Tủ ấm CO2

- Máy tính cài phần mềm đọc API (nếu có)

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị	Số lượng
1	Lam kính	Cái
2	Que cấy	Cái
3	Dầu soi kính	ml
4	Cồn 96 độ lau kính	ml
5	Nước muối sinh lý	ml
6	Thuốc nhuộm đỏ Fucsin	ml
7	Thuốc nhuộm tím Gentian	ml
8	Cồn tẩy 96 độ	ml
9	Lugol	ml
10	Thuốc nhuộm Xanh Methylen	ml
11	Canh thang BHI 5 ml	ống
12	Môi trường thạch máu thường	Đĩa
13	Môi trường Chromatic detection	Đĩa
14	Bông	Kg
15	Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ)	ml
16	Đèn cồn	Cái
17	Panh	Cái
18	Khay đựng bệnh phẩm	Cái
19	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	Cái
20	Mũ	Cái
21	Khẩu trang	Cái
22	Găng tay	Đôi
23	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi
24	Quần áo	Bộ
25	Ống nghiệm thủy tinh	Ống
26	Bút viết kính	Cái
27	Bút bi	Cái
28	Bật lửa	Cái
29	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ
30	Cồn sát trùng tay nhanh	ml
31	Dung dịch nước rửa tay	ml
32	Khăn lau tay	Cái
33	Giấy trả kết quả xét nghiệm	Tờ
34	QC
35	EQAS

Môi trường nuôi cấy và hóa chất định danh vi khuẩn được tính trên tỉ lệ dương tính trung bình là 50 % cho các loại bệnh phẩm.

* Ghi chú:

- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

VIII. NỘI DUNG

Lấy bệnh phẩm

- Chọn địa điểm, số lượng mẫu và thời gian lấy mẫu có thể đánh giá chất lượng vi khuẩn học toàn bộ nguồn nước thải bệnh viện. Thường lấy tại bể tập trung toàn bệnh viện để đánh giá ô nhiễm vi sinh từ đầu nguồn. Lấy mẫu sau từng giai đoạn xử lý và đầu ra sau xử lý. Vì lượng nước thải không đều, nên lấy mẫu vào nhiều thời điểm trong ngày rồi trộn các mẫu lại thành một mẫu gọi là mẫu trộn.

- Dùng quang chai đã khử khuẩn bằng nhiệt độ bông cồn. Dìm quang chai sâu cách mặt nước 30 cm, khi nước gần đầy chai thì kéo lên để lại trống chừng khoảng 2 - 3 cm từ mặt dưới nút chai trở xuống để tránh nhiễm khuẩn từ miệng nút chai và để khi phân tích lắc trộn mẫu được dễ dàng. Dùng chai thuỷ tinh, nút mài vô khuẩn lấy 100 ml cho mục đích kiểm tra chất lượng về vi khuẩn học, 1.000ml cho phân tích vi khuẩn gây bệnh. Lấy xong đốt miệng lọ để sát khuẩn và đậy kín ống nghiệm. Khử khuẩn tại miệng chai nút chai, đóng nút nhanh và bao lại miệng chai cẩn thận.

- Nếu không có quang chai, phải rửa tay xà phòng sạch sẽ, lau cồn khử khuẩn tay. Sau đó cầm gần đáy chai, dìm chai xuống nước, đặt chai nằm ngang hơi chúc đầu xuống độ sâu khoảng 15-20 cm để ngang chai tạo dòng nước tự chảy vào miệng chai, tránh lấy nước trên bề mặt. Các thao tác khác thực hiện như đã mô tả ở trên.

- Trường hợp không lấy được trực tiếp, phải dùng xô, gầu múc, cần đổ bỏ 3 lần, lần thứ tư mới rót nhẹ nhàng vào chai sao cho tay không làm nhiễm bẩn mẫu nước.

Tiến hành kỹ thuật dịnh lượng coliform bằng kỹ thuật đếm số có xác xuất lớn nhất (MPN: Most probable number):

Phương pháp cấy nhiều ống:

- Chuẩn bị: Có thể xếp 5 hàng, mỗi hàng 3 ống hoặc 5 ống, hàng đầu là những ống canh thang lactose đặc và 2 hàng sau là những ống canh thang lactose loãng.

- Pha loãng: hút vô khuẩn 1ml mẫu nước nguyên cho vào nước muối sinh lý 0,85% chứa 9 ml để có đậm độ pha loãng 10^-1. Hút trộn lên xuống 20 - 25 lần để trộn đều mẫu với nước muối. Từ đậm độ này, lại hút 1ml chuyển sang ống nước muối thứ 2, có đậm độ pha loãng10^-2. Cứ như thế pha loãng tới đậm độ cần thiết. Mỗi đậm độ thay pipet mới.

+ Hàng thứ nhất xếp 3 ống canh thang lactose đặc, cấy mỗi ống 10 ml nước mẫu.

+ Hàng thứ 2 xếp 3 ống canh thang lactose loãng, cấy mỗi ống 1 ml mẫu nước.

+ Hàng thứ 3 xếp 3 ống canh thang lactose loãng, cấy mỗi ống 1 ml mẫu nước đậm độ 10-1.

+ Hàng thứ 4, 5,... tiếp tục cấy đến đậm độ cần thiết.

- Nuôi cấy và ủ ấm 35-37^oC trong vòng 48 giờ ± 3, khí trường thường.

- Đọc kết quả: Những ống lên men lactose sinh acid, chuyển màu môi trường xanh sang vàng và sinh hơi trong ống sinh hơi được coi là dương tính (+). Ghi tất cả những ống (+) theo các đậm độ cấy:

+ 3 ống canh thang lactose đặc, cấy 10 ml, (+) cả 3 ghi 3

+ 3 ống canh thang lactose loãng, cấy 1 ml nước (+) cả 3 ghi 3

+ 3 ống canh thang lactose, loãng, cấy 1 ml nước 10-1 (+) cả 3 ghi 3

+ 3 ống canh thang lactose loãng, cấy 1 ml nước 10-2 , chỉ (+) 2 ghi 2

+ 3 ống canh thang lactose loãng, cấy 1 ml nước 10-3, (-) cả 3 ghi 0

Xác định dãy số phương pháp nhiều ống là: 3 3 3 2 0

Lưu ý

• Nếu xét nghiệm mẫu nước thải có số lượng coliform vượt quá tiêu chuẩn qui định cần áp dụng một số biện pháp can thiệp tạm thời cho đến khi nguồn nước được xử lý

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

- Định lượng Coliform : Chọn các ống lên men lactose và sinh hơi trong canh thang để xác định được các dãy số. Tra bảng MPN cho phương pháp cấy 9 ống hoặc 15 ống để tính số lượng vi khuẩn/100 ml nước

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

• Đảm bảo không bị lây nhiễm

XI. AN TOÀN

• Phải sử dụng bảo hộ cá nhân đầy đủ;
• Các kỹ thuật phải được tiến hành trong tủ an toàn sinh học.

XII. HỒ SƠ LƯU

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN